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芝麻素減輕自發性高血壓大鼠腎臟纖維化作用及其機制討論論文

時間:2021-04-06 19:55:23 論文 我要投稿

芝麻素減輕自發性高血壓大鼠腎臟纖維化作用及其機制討論論文

  原發性高血壓是發病率較高的常見疾病。發病率呈逐年上升趨勢,若不及時治療,可發展為慢性腎衰竭或尿毒癥而危及生命。目前,高血壓腎病機制尚不十分清楚,其主要的病理改變為腎間質纖維化與腎小球硬化。其中腎間質纖維化是決定腎臟疾病發展和預后的重要因素,是所有原發或繼發慢性腎臟疾病進展至終末期腎衰竭的共同途徑。芝麻素( sesamin,Ses) 是從芝麻中提取出來的有效活性成分,具有調節血壓、血脂,保護與改善肝腎功能及抗腫瘤等藥理作用。本課題組前期研究已證實,Ses 具有減輕自發性高血壓大鼠腎損傷的保護作用,但深入的機制尚不清楚。本實驗以自發性高血壓大鼠( SHR) 為研究對象,探討Ses 減輕大鼠腎臟纖維化的作用及其可能存在的機制。

芝麻素減輕自發性高血壓大鼠腎臟纖維化作用及其機制討論論文

  1 材料與方法

  1. 1 藥品和試劑

  芝麻素( 分子式C20H15O6,相對分子質量354. 34,純度≥98%) ,購自上海純優生物科技有限公司; 卡托普利片( 批號:13030711) ,購自常州制藥廠有限公司; 丙二醛( MDA) 、超氧化物歧化酶( SOD) 、BCA( bicinchoninicacid) 蛋白濃度檢測試劑盒、α-平滑肌肌動蛋白( α-SMA,批號: AA132) 抗體均購自碧云天生物技術研究所; 轉化生長因子-β1( TGF-β1,批號:BA0290 ) 、基質金屬蛋白酶-9 ( MMP-9,批號:BA2202) 、基質金屬蛋白酶的組織抑制劑-1( TIMP-1,批號: BA3727) 抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司。

  1. 2 儀器

  ALC-NIBP 無創尾動脈血壓測定分析系統( 上海奧爾科特生物科技有限公司) ; DYCP-34A 型電泳槽、DYY-Ⅲ-8B 穩壓穩流電泳( 北京六一儀器廠) ; Mini PROTEAN 轉膜系統、MiniPROTEAN 電泳系統( 美國Bio-Rad 公司) ; CS-15臺式離心機( Beckman Coulter) ; SIEMENS RXLMAX全自動生化儀( 上海西門子有限公司) 。

  1. 3 實驗

  動物及分組10 周齡雄性SHR 大鼠28 只,WKY 大鼠7 只,體質量180 ~ 200 g,由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供,許可證號為SCXK ( 滬) 2012-0002, 合格證號為2007000552035。大鼠每4 只1 籠進行飼養,自然光照,室溫( 23 ± 2) ℃,相對濕度60% ~ 65%,動物可自由進食飲水。SHR 大鼠適應性喂養3周后,隨機分為4 組: 模型( SHR) 組、芝麻素低、高( 80、160 mg /kg) 劑量組及卡托普利( 30 mg /kg)組,以同周齡WKY 大鼠作為對照組。按上述設定劑量灌胃給藥,每日一次,連續12 周。

  1. 4 測量

  血壓采用尾動脈無創測壓法。在干燥、安靜的環境中,將清醒狀態下的大鼠放置于37 ℃ 恒溫袋內預熱15 min,用ALC-NIBP 無創血壓計測量尾動脈舒張壓,在大鼠安靜狀態下連續測定3 次,每次間隔1 ~ 2 min,取其平均值。

  1. 5 生化指標檢測

  全自動生物化學分析儀測定各組大鼠血清肌酐( Scr) 、尿素氮( BUN) 和尿微量白蛋白( U-mAlb) 含量; 黃嘌呤氧化酶法測定SOD; 硫代巴比妥酸法測定MDA。具體方法、操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

  1. 6 腎臟病理學變化

  觀察給藥12 周后, 10%水合氯醛( 0. 33 g /kg,i . p. ) 麻醉各組大鼠,取腎臟組織,置入4%多聚甲醛溶液中固定48 h 后,常規石蠟包埋、切片、脫蠟、水化等,進行HE 和Masson染色,光鏡下觀察腎臟病理學變化。

  1. 7 免疫組織化學法測

  TGF-β1、α-SMA 陽性細胞的表達按照厚度約為5 μm/片的標準將各組大鼠腎臟石蠟橫斷面連續切5 ~ 6 片,切片常規脫蠟至水。嚴格按照免疫組化試劑盒說明書操作。將免疫組化染色的切片在光鏡下統一放大10 ×40 倍,采用Image-pro plus 圖像分析軟件進行半定量分析,將每只大鼠腎組織染色切片各取5 個相同單位面積的區域,棕黃色顆粒為陽性細胞,測定TGF-β1及α-SMA 陽性細胞的積分光密度值( IOD) ,計算其平均積分光密度值( AIOD) 。

  1. 8 Western blot 測TGF-β1、α-SMA、MMP-9、TIMP-1 蛋白的表達

  RIPA 裂解液裂解腎組織,提取細胞總蛋白,BCA 法測蛋白濃度,每孔上樣50 μg 蛋白,SDS-PAGE( 12%) 電泳分離樣品。電泳后的蛋白轉移至PVDF 膜上,室溫下封閉液封閉1 h,一抗孵育( 4 ℃) 過夜。然后用洗滌液洗膜10 min × 3 次,再將膜浸入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG( H + L) ( 1∶ 2 000) 中,室溫下孵育60 min,洗膜10 min × 3 次,ECL 發光顯色,曝光、顯影及定影,采用Image J 1. 43 軟件進行數據處理,條帶強度用集成光密度值表示。( 目的蛋白集成密度值/β-actin 集成密度值) 為目的蛋白表達強度。

  1. 9 統計學處理結果

  采用SPSS 13. 0 軟件進行分析,所有數據均以均數± 標準差( x ± s) 表示,2 組間比較,方差不齊用t' 檢驗,方差齊用非配對t 檢驗,多組比較采用單因素方差分析( ANOVA)分析。P < 0. 05 為組間差異具有統計學意義。

  2 結果

  2. 1 芝麻素對SHR 大鼠舒張壓的影響給藥前,各組SHR 大鼠舒張壓均明顯高于正常組( P< 0. 01) 。當模型組大鼠給藥治療后,在12 周內其舒張壓隨時間的延長逐漸下降,尤其在給藥第8 周后,與模型組比較,芝麻素各劑量組與卡托普利組大鼠舒張壓明顯下降( P < 0. 01) 。提示芝麻素具有一定降低SHR 大鼠血壓的作用。

  2. 2 芝麻素對SHR 大鼠生化指標的影響與正常組比較,模型組大鼠Scr、BUN、U-mAlb 及MDA含量明顯升高,SOD 水平顯著降低( P < 0. 01) 。與模型組相比,芝麻素低、高劑量組及卡托普利組Scr、BUN、U-mAlb、MDA 含量均顯著下降,SOD水平明顯提高( P < 0. 05,P < 0. 01) ,其中芝麻素高劑量組與卡托普利組效果更明顯 。提示芝麻素具有減輕SHR 大鼠腎損傷的作用,可能與其抗氧化應激作用有關。

  2. 3 芝麻素對SHR 大鼠腎臟形態學的影響正常組腎小球和腎小管結構均正常。與正常組比較,HE 結果顯示模型組大鼠腎小球系膜區基質增多,腎小管上皮細胞出現顆粒變性伴萎縮,腎間質發生纖維化伴淋巴-單核細胞浸潤; Masson 染色結果顯示腎小球系膜區與腎小管周圍出現大量藍染膠原沉積,纖維增生和間質纖維化。與模型組相比較,用藥組HE、Masson 染色均顯示腎小球系膜基質增生和腎小管上皮細胞變性明顯減少,膠原沉積和腎間質纖維化程度顯著減輕。提示芝麻素具有一定改善SHR 大鼠腎臟纖維化的作用。

  2. 4 芝麻素對SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細胞表達的影響正常組大鼠腎小管上皮細胞、基膜和腎間質中,極少表達TGF-β1、α-SMA,僅見很少量的棕黃色顆粒沉積; 模型組TGF-β1陽性細胞表達主要在腎小管上皮細胞,可見大量棕黃色顆粒沉積,α-SMA 陽性細胞表達主要在腎小管基膜及腎間質中,出現大量棕黃色顆粒沉積; 而用藥組腎小管基膜、上皮細胞及腎間質中棕黃色顆粒沉積明顯減少。半定量分析結果顯示,與正常組比較,模型組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細胞表達明顯增強( P < 0. 01) ; 而與模型組相比,芝麻素、卡托普利能不同程度地減弱大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細胞表達( P<0. 05,P < 0. 01) 。提示芝麻素具有下調SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細胞表達的作用。

  2. 5 芝麻素對SHR 大鼠腎組織TGF - β1、α-SMA 蛋白表達的影響模型組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達水平與正常組比較,顯著增加( P < 0. 01) ; 而與模型組相比,芝麻素與卡托普利能不同程度地降低SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白表達水平,差異具有顯著統計學意義( P < 0. 05,P < 0. 01,圖4) 。提示芝麻素可下調SHR 大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 蛋白的表達水平。

  2. 6 芝麻素對SHR 大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1 蛋白表達水平的影響與正常組比較,模型組大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1 蛋白表達水平增強,尤其是TIMP-1 表達顯著增強,MMP-9 /TIMP-1 比值明顯降低( P < 0. 01) ; 與模型組比較,芝麻素高劑量組及卡托普利組大鼠腎臟MMP-9、TIMP-1 蛋白表達水平降低,且TIMP-1 表達水平下降更顯著,MMP-9 /TIMP-1 比值明顯增大( P < 0. 05,P<0. 01) 。提示芝麻素能下調SHR 大鼠腎組織MMP-9 和TIMP-1 蛋白的過度表達,尤其下調TIMP-1 表達更為顯著,增大MMP-9 /TIMP-1 比值。

  3 討論

  腎纖維化是高血壓的常見并發癥之一,是反映腎功能損傷程度的最主要指標。腎纖維化形成的主要機制包括膠原過量聚集、細胞外基質( ECM) 在腎間質過度積聚與沉積、α-SMA 不斷活化、成纖維細胞大量增生等。腎纖維化若不積極治療最終可發展為腎衰竭而危及生命。血管緊張素轉換酶抑制劑卡托普利已廣泛應用于心衰、高血壓及腎臟疾病等治療。它不僅具有抗脂質過氧化、降低血壓等作用,而且能有效降低血肌酐、尿蛋白排泄,改善腎小球血流動力學指標,延緩腎小球硬化等。因此,本實驗運用卡托普利作為陽性對照藥。

  實驗中,HE 和Masson 染色結果顯示,模型組大鼠腎小球系膜區基質伴有增生和膠原纖維沉積,腎小管上皮細胞發生顆粒變性伴萎縮,腎間質出現大量藍染膠原纖維增生,提示高血壓時腎臟發生纖維化。用藥后,芝麻素明顯改善腎小管及腎間質病變,表明芝麻素可減輕SHR 大鼠腎損傷,該結果與前人報道基本一致。研究還發現給予芝麻素處理后,在12 周內,模型組大鼠舒張壓隨著治療時間的延長而降低,尤其在治療后第8 周下降明顯,且以芝麻素高劑量組效果顯著,提示芝麻素具有降低SHR 大鼠血壓的作用,呈劑量依賴性,其結果與本課題組前人報道一致。UmAlb是高血壓早期腎功能損害的檢測指標,BUN、Scr 是反映中晚期腎功能改變的常用指標。本實驗發現,模型組大鼠U-mAlb、BUN、Scr 含量均顯著升高,而芝麻素能明顯降低以上指標,尤其是高劑量組效果顯著。

  研究已證實氧化應激反應是高血壓腎損傷進展的重要因素之一,持續高血壓狀態可使氧化應激水平增加,抗氧化活性降低,使活性氧簇的生成顯著超過機體清除能力,從而導致機體腎組織結構損傷。MDA 水平反映機體脂質過氧化程度和含量,間接反映細胞受自由基攻擊的損傷程度,SOD 屬于機體內氧自由基清除酶體系重要成員之一。本研究結果顯示,模型組大鼠腎臟MDA含量顯著升高,SOD 活性明顯降低。與模型組相比,芝麻素組及卡托普利組MDA 含量明顯減少,SOD 活性顯著升高。提示芝麻素可通過提高腎臟SOD 活性,降低MDA 含量來抑制高血壓腎臟過度激活的.氧化應激反應。TGF-β1是最重要的促纖維化因子,參與誘導腎臟纖維化過程中的多個環節。大量研究證實,持續高血壓狀態會導致機體抗氧化活性下降,氧化應激水平增加,促使腎臟細胞發生氧化應激反應,導致活性氧簇生成增多,從而上調一些細胞因子的表達,如TGF-β1、結締組織生長因子( CTGF)等,進而促使腎小管上皮細胞-間充質細胞轉分化成為肌成纖維細胞,而肌成纖維細胞是合成ECM 的主要細胞。α-SMA 是肌成纖維細胞的標志物,在TGF-β1刺激下,α-SMA 會明顯活化,表達顯著上升; TGF-β1等細胞因子還可促使基質金屬蛋白酶類( matrix metalloproteinases,MMPs)及其特異性抑制劑組織金屬蛋白酶抑制物( tissueinhibitors of metalloproteinases,TIMPs) 過度表達,引起ECM 過度沉積,抑制蛋白酶生成,減少基質降解等,從而最終導致腎臟纖維化。本研究結果顯示,模型組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA 陽性細胞和蛋白表達均顯著增加,表明持續高血壓狀態過度激活TGF-β1、α-SMA 的活性。而給予芝麻素處理后,兩者陽性細胞和蛋白表達均明顯減少,提示芝麻素可下調SHR 大鼠腎臟過度激活的TGF-β1,進而進一步阻滯α-SMA 活化,從而抑制腎小管上皮細胞-間充質細胞轉分化為肌成纖維細胞,有效遏制腎臟纖維化的進程。

  MMPs /TIMPs 是參與腎臟細胞外基質降解的重要酶系統,其活性變化對于維持腎臟ECM 生成與降解的動態平衡十分重要。文獻報道,在持續高血壓狀態下,過度激活的TGF-β1可與腎小球高壓相互作用,促使腎組織ECM 降解系統尤其是MMPs /TIMPs 功能紊亂,引起兩者過度表達或平衡失調,抑制ECM 降解,促進其生成,從而最終導致腎間質纖維化。MMPs 能水解ECM 中的各種蛋白成分,其活化被認為是ECM 降解的限速關鍵環節,其中MMP-9 主要降解膠原與明膠等,從而緩解腎間質纖維化。TIMP-1 是MMP-9 特異性抑制劑,正常情況下MMP-9 與TIMP-1 按1∶ 1比例釋放,兩者共同維持ECM 生成與降解的平衡。有研究表明,腎硬化等ECM 增多的疾病中均有TIMP-1 過度表達或MMP-9 /TIMP-1 比值降低。本實驗結果發現,模型組大鼠腎組織MMP-9、TIMP-1 表達均增強,且TIMP-1 表達增強較MMP-9 更為顯著,MMP-9 /TIMP-1 比值明顯降低,與前人文獻報道結果一致。而給予芝麻素處理后,MMP-9、TIMP-1 表達均減弱,但TIMP-1表達減弱較MMP-9 更明顯,MMP-9 /TIMP-1 比值顯著升高。提示持續高血壓狀態下,腎臟TGF-β1表達增多,促使MMP-9 與TIMP-1 過度表達或失衡,尤其是TIMP-1 表達顯著增強,從而進一步加重腎組織腎間質纖維化進程。而芝麻素能有效下調MMP-9 及TIMP-1 在腎組織的過度表達,尤其下調TIMP-1 表達更顯著,上調MMP-9 /TIMP-1,恢復MMP-9 與TIMP-1 間的平衡,減少細胞外基質積聚與沉積,從而減輕腎臟纖維化。綜上所述,本課題組推測芝麻素可能是通過其降壓和抗氧化應激反應,抑制TGF-β1過度激活,進而阻滯α-SMA 活化,下調TIMP-1 過度表達,上調MMP-9 /TIMP-1,恢復MMP-9 與TIMP-1間平衡,從而減少膠原過量聚集、ECM 在腎間質過度積聚及成纖維細胞大量增生等,發揮減輕自發性高血壓大鼠腎臟纖維化作用。但其深入而全面的機制還有待于進一步研究。

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